你的种子摇的不一定够。我觉得你可以从甘油管接种到5ml试管，28度过夜，然后测定OD600的吸光值，一般经验是可以达到3－5个OD，可以按照5％转接到二级种子5ml试管，37度培养到OD600＝0.5左右，然后IPTG诱导。你用的IPTG浓度梯度差别不大，不知道你的蛋白溶解性怎么样？是否有可溶表达的报道呢？你可以做一个IPTG浓度梯度的单因素实验，从0.05mM，到1mM，温度25度到30度诱导，4－8h后跑全菌电泳，看看是否有目标蛋白的条带。

我之前做表达的时候,晚上摇菌,第二天早上取50微升,加到3毫升,继续摇,大约4个小时,OD0.4--0.6就可以加IPTG诱导,诱导一段时间,后面的提取蛋白,上样,电泳,就可以了.一般都可以得.

1. 进行诱导表达优化，温度20---37选择不同的，IPTG浓度从0.01mM到1mM，诱导时间4---8h。2. 诱导前的活化也很重要，OD值一般要达到0.5--1.0，才可以加IPTG。3. 诱导后，取诱导前后的菌，跑电泳。4. 工作量很大，你要有耐心，不要急！我就是这样摸条件的，最后表达出目的蛋白的。若还不出，可以换载体看看！

我的经验是不要用试管诱导！用锥形瓶。然后用8层纱布封口，不要用棉塞。增加透气性。我遇到过这个问题，就这么解决的。前提是你的重组子本身没有问题。

转速是个比较次要的因素，一般200rpm左右都可以。你可以把表达条件用3ml试管做单因素实验，考察一下IPTG浓度、诱导时限、诱导时间、温度这四个因素的影响。经验上看，pet28一般用于周质表达，诱导条件是0.05mM IPTG，25度，诱导6－8小时。如果还是没有表达，就不要在表达上多花时间了。蛋白不表达和很多因素有关：蛋白毒性、偏好密码子、可溶性、分子量等等。如果可能，可以考虑更换质粒或宿主菌。

建议你最好测序看看了，我在实验室遇到过相同的情况，测序后发现PCR扩增基因时候丢失一个碱基发生移码突变。

我作表达时是先100ul接到5ml中摇过夜，第二天早上取50ul接到5ml中再摇2～3h,先取1ml未诱导的作对照，接着加1mM IPTG，隔一小时收1ml菌。然后将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2*裂解缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。

30a用的什么酶切位点，注意移码突变，可以考虑NdeI和HindIII酶切位点，如果用其他的要注意加碱基