实验中通过Western blot鉴定出一种目的蛋白,约29KD.因为纯化工作比较困难,所以想直接跑单向SDS-PAGE,然后切胶进行PMF,是否可行?如果转膜后进行N-端测序的话,对于鉴定这种蛋白是否更有说服意义?
可以,但要保证样品量,跑胶时尽量跑开点.鉴定的方法越多,说服意义当然越大。不过仅仅是鉴定一下蛋白质,又不纯化分离,做这么多鉴定有必要吗?
同意楼上意见,Western blot鉴定比pmf要准确的多。没看很多文章做了pmf后,都要经过western来确认。不过对于小分子量的蛋白质来说,n-端测序可能比pmf更有效!
直接跑一维PAGE胶来测序或者单独做pmf,都是不可取的。除非你的样品相对比较纯!
使用SDS-PAGE分离,再将蛋白胶切下来做PMF是完全可行的。但是PMF比对的是肽谱图,存在一定的假阳性概率,因此对蛋白纯度的要求较高。所以,建议SDS胶跑开一些,保证切下来的蛋白胶不被其他蛋白胶影响,另外,切胶的时候注意不能被角蛋白等杂蛋白污染。PMF鉴定效率都比N端测序要更高,价格也更低。但是蛋白量、蛋白纯度足够高的话,PMF的结果也是同样可信的。