大多数细胞在normoxia条件下用Western很难检测到内源性hif-1a的表达，在一些VHL基因缺失的细胞可以检测到。如果使用CoCl2处理了细胞，据我的观察，250uM CoCl2 2h,然后用PBS 洗去CoCl2换上普通培养液，半小时甚至1小时之内hif-1a的表达仍然比较高，很容易检测到。常规处理细胞收集细胞裂解液即可，我用RIPA buffer,效果很好，大家有兴趣不妨一试，效果好的话希望反馈在这儿让大家分享。

提蛋白时，不要让你的样品离开冰盒，或者在冷库中操作(如果条件允许)；加入蛋白酶抑制剂。后续实验，除了保存要在超低温冰箱并防止反复冻融外，能在冰上操作的在冰上操作就好了。蛋白加入loading buffer煮开数分钟，是让蛋白完全变性，以后的实验就基本上不用担心蛋白降解的问题了。

提蛋白速度要快，用厌氧缺氧箱处理效果比较好

我最近也一直在做HIF-1a 的WB，做的是脑组织，蛋白裂解时加了蛋白酶抑制剂，未用氯化钴刺激。分离胶8％，浓缩胶4％，湿转380MA(100v)2小时，一抗是R&D的干粉剂（单克隆），用消毒PBS溶解，浓度2UG/ML，二抗是进口的1:500~1:1000,但是多数没做出来，内参出来了。（上样量40UG），有一次同一泳道出现三个条带，都很浅，而说明书上只有一个条带。