Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。我用stripping buffer之后还是做同一种抗体，只不过根据ECL效果调整抗体浓度。和重新跑胶、转膜相比，呵呵，能节省点时间。由于重复使用，蛋白信号会有一定减弱，所以我一般用三次，感觉还可以。网上很多配方，可以自己配的。祝一切顺利！

1、stripping buffer 含有适量的sds，在低ph值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。

2、完全可以用同一种抗体再杂交一次。我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是一次比一次递减的。

strip的配方有多种，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。

Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.另外,stripping一般都不完全,含SDS的强stripping配方容易造成膜上蛋白丢失,一般推荐使用中度强度的低pH Glycine,可加热的配方.

如果你的蛋白分子量相差较大，可以直接用TBST洗膜，3次*10min，然后就封闭，孵育一抗和二抗，后面的步骤都一样的，效果不错，我们做过。

如果要检测A和B两个蛋白,两个的MW假设为A=43kD, B=55kD，A为高丰度蛋白,B为低丰度蛋白. 如果根据prestained marker来剪的话经常容易切错.所以我的推荐的做法是不切开.第一次IB,先做低丰度的B蛋白,做完以后(确保PVDF膜湿润,如果在暴光中膜干了，用甲醇重新浸泡以确保湿润)可以直接做后面的A蛋白.或者更保险的方法(将膜TBS或封闭液中4度过夜,或者用0.1MGlycine-HCl,pH2.2处理15-30min后再重新封闭进行下一轮的IB)