很多情况都会导致荧光淬灭，可能每个人的情况并不相同。

【1】用保鲜膜包好的带荧光的膜，千万不要放到金属表面，碰到金属表面，荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的，所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些提到用镊子碰到膜会导致荧光淬灭，可能是因为镊子是金属的缘故。

【2】不注意的时候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也会导致荧光淬灭。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。

【3】荧光可能对一些物质敏感，导致荧光淬灭。所以，尽量使和荧光接触的物品都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜，然后曝光，但是保鲜膜太薄，容易卷起来，我就用较厚的塑料袋，但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭，我估计可能是因为后塑料袋上不干净，有些导致淬灭的物质。后来继续应用保鲜膜，就没有出现类似情况了。

【4】荧光淬灭和蛋白抗体等也有原因。我以前就碰到过，我的是5个条带，发生淬灭的时候，有快有慢，不是5个条带一起淬灭。尽管后来都淬灭了。所以，估计和蛋白抗体等也有关系，但可能并不是主要的原因。

我发两个荧光淬灭的小教训，供大家参考，一次，我在NC膜上加入发光试剂，在肉眼清晰可见发光条带，可是往保鲜膜上一放，其中的一条发光带马上淬灭。不到一分钟，另外一条也淬灭了。事后，我考虑是保鲜膜的原因，所以，在做实验的时候，大家一定不要怕麻烦，把保鲜膜反复清洗，洗干净。另外一次，发光带相当亮，我连续曝了三张片大约快有十来分钟了，还是相当亮。我曝完片子的时候，拿NC膜的时候，我用镊子碰了一下发光带，马上荧光淬灭，最后，我再用发光液反应的时候，荧光再也不出现了。所以，大家在操作的时候，千万不要用镊子来碰这个敏感的部位。具体的原因我也想不清楚。也许从发光反应的本质还能得到一点启发吧。

淬灭后你曝光X片上有条带吗？我有时候加显色底物后也看不到荧光，压片时间延长也有条带啊

荧光的快速淬灭应该不是你上样量和二抗的问题。很多国产二抗效价根本达不到1：5000的。此外，如果60 ug的上样量，ECL就出问题了，我想PIERCE的质量也太差了。因为没用过PIERCE的ECL试剂盒，所以只能根据我的经验来猜测几种可能：1. ECL试剂盒应该有A液和B液。A液是发光物，B液是0.1％的过氧化氢。所以，你回忆一下，在取A液和B液的时候会不会忘了换枪头，导致AB液之间有污染，容易造成ECL效果减弱。2. A液要严格低温避光保存，会不会在亮光的房间里打开过A液。3. 仔细检查你用到的缓冲液，如TBST或者STRIPPING buffer，看看PH是不是有明显改变。

关于能看到荧光淬灭快的问题，我也碰到过多次，根据我自己的经验建议如下解决：首先考虑底物的问题，这是最有可能发生的。就算这个底物上次使用没有问题，别人用也没有问题。也首选考虑换底物。另外需要注意的是已经使用过不好的底物的膜建议换底物也没有用。最好重新跑胶转膜。以下两条均在底物确认多次无问题的情况下实施。然后考虑二抗的问题。重新换二抗或者稀释二抗的浓度。上样量减少。对于局部荧光淬灭很有可能与您的操作如不干净的保鲜膜或者金属镊子碰到相关。总之，遇到相关问题要积极探索，周全想到每一个环节。祝大家实验顺利。

如果不是发光剂的问题，操作是否在暗室操作，在明光下加A，B液，淬灭可能快了点，淬灭快，还是可能二抗和发光剂的问题，建议在暗室操作，EP管里或干净的塑料膜上加一点1：2000的二抗，再加入混合均匀的发光剂，有无荧光淬灭现象，如果有，还是二抗或发光剂的问题，再换发光剂或二抗试下

我用ECL效果很好，不会很快消失的 ，但是操作要快点好