CD31是出了名不好染啊，如果不是非要看CD31而只是要看血管的话，建议用Lectin，百试百灵，荧光，color通杀。

（1）石蜡切片脱蜡、水化处理。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min ，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min，95%酒精2min，80%酒精2min，70%酒精2min，过蒸馏水5min，过PBS 5min。

（2）细胞通透液处理。取配制好的TritonX-100溶液4ml，加40ul的30%H2O2，充分混合，滴加到组织片上，避光，室温通透30min。

（3）抗原修复。采用电炉水浴修复。通透结束后，PBS洗涤3次×3min，将组织片放入到水浴中进行抗原修复。此时，外层水为沸腾水，而内层修复液温度维持在85℃左右，关掉电炉，将水浴烧杯从电炉上拿下，自然冷却至室温或者自来水降温。

（4）封闭内源性过氧化物酶。修复结束后，PBS洗涤3次×3min，滴加3%H2O2—甲醇溶液于组织片上，室温，封闭20min。

（5）封闭非特异性蛋白。内源性过氧化物酶封闭结束后，PBS洗涤3次×3min，滴加正常羊血清，按1：800倍稀释，37℃封闭30min。

（6）勿洗，加一抗第八因子、CD34、CD31，按1：200倍稀释，阴性对照用PBS代替一抗。4℃冰箱过夜。

（7）第二天，37℃复温30min，PBS洗涤3次×3min。

（8）滴加二抗。按1：800稀释，37℃孵育85min。

（9）二抗孵育结束，PBS洗涤3次×3min。

（10）滴加HRP-链霉卵白素液，按1：800稀释，37℃孵育35min。

（11）结束后，PBS洗涤3次×3min。

（12）DAB显色。DAB为浓缩型试剂盒，按1：40倍稀释。显微镜下控制显色结果。

（13）自来水终止显色。

（14）脱水、透明、封片。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。注：因课题的需要，我没有进行复染。

我用过CD31、八因子、CD34做过微血管的免疫组化。从结果来看CD31的效果最好。我的组织块是用多聚甲醛固定的，个人觉得甲醛与多聚甲醛固定差别不是很大。

for PFA fixed mice tissue，u must use trypsin or pepsin retrievel,citrate buffer boiling does not work，for liquid-nitrogen freezed tissue，dry a little bit and fix in acetone, cut at 10 um.

动物组织石蜡切片（即你固定后的）的CD31不好染出阳性结果，你试试冰冻组织，即切下组织用95%乙醇固定十分钟后，放4°冰箱，恢复室温10分钟后，进行免疫组化CD31染色。

CD31是常见的血管内皮染色，耐心点。小鼠皮下移植瘤血管内皮CD31染色，CD31是BD公司的。组织切片是多聚甲醛固定，梯度蔗糖脱水处理的，荧光染色结果是没有阳性染色。这一步建议用多聚甲醛灌洗供血血管，将移植瘤内小血管中血液冲出即可，不要长时间固定；然后30%糖水脱水，组织沉下即可包埋。文献上是将组织直接液氮速冻，再做冰冻切片，然后丙酮固定，染色。可我按照这种方法做的时候，发现组织根本无法切片，很容易破碎。这一步需要将组织置入OCT中，然后再用液氮或者-80度冰箱速冻，修后再进行切片；切片后尽早丙酮固定。

4%甲醛固定完，甲醛泡30分钟以内，CD31出的挺好，泡时间长了就不出了，我也用的BD的CD31，出的挺好，另外多聚甲醛和中性甲醛效果没什么差别。