看图应该不是引物二聚体，最下边的两条带像引物二聚体，跟退火温度或者引物特异性应该关系不大，引物二聚体条带一般在100bp左右，条带弥散模糊，去掉引物二聚体可以考虑在体系中加DMSO，PCR冷启动等，有没有考虑过是同一个基因的另一个转录本？我之前扩增一个基因的全长就会有这样，能扩出两个转录本，突变体比野生型小50bp左右

就是反应体系里加DMSO，我一般25ul体系加1-2ul，可以摸索，PCR冷启动就是在冰上操作，这个也可以一定程度上抑制非特异性结合，有很多帖子讲了如何抑制引物二聚体的可以搜索。突变体的话如果不能针对单一转录本设计引物的话是不能解决问题的，你只是测基因表达量的话建议针几个转录本的相同部位设计引物，设计好的引物用blast验证，产物长度200bp左右比较好

提高Tm技术上可行，但是考虑到内参的扩增可能离开了最佳的Tm，我的好几对引物也是这个原因换的。个人觉得换引物更加简单直接

最常见的的方法就是优化反应条件吧，提高Tm试试。

因为体系中的模板是由多个cDNA的混合物构成，有可能发生引物与非目的模板退火，几乎无法完全杜绝此现象。解决办法是针对同一基因多设计几对保守引物，扩增后全跑琼脂糖电泳验证，看哪个引物没有产生非特异扩增带，就用哪个引物。其他产生非特异带的引物就不要用了。

引物退火温度不合适，提高退火温度试试，估计会和内参的温度不同，分开也可以，就是麻烦一点